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  • 免疫組織化學(IHC)實驗在組織芯片上的操作流程及建議
    來源:    發布時間: 2017-12-26 16:31   288 次瀏覽   大小:  16px  14px  12px
    ——西安艾?

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    以本實驗實常用兩種實驗方法為例(下面兩種方法均為手工操作,如無特殊說明,均在室溫下進行)

    (一)S-P 法:UltraSensitive TM SP 檢測試劑盒

    1)? 60 ℃ 烤片 30 分鐘,常規脫蠟水化;

    2)? 根據每一種抗體的要求,對組織抗原進行相應的修復【一般選用 Tris-EDTA (pH 8.0) 微波修復抗原,冷卻至室溫,三羥甲基氨基甲烷 (Tris) 鹽緩沖液,PBS 洗 5 分鐘×3 次】

    3)? 用 3% H202-甲醇封閉內源性過氧化物酶,室溫 10 分鐘,PBS 洗 5 分鐘×3 次;

    4)滴加正常非免疫動物血清,室溫 10 分鐘;

    5)? 除去血清,滴加一抗(即用型/濃縮型, 選擇合適濃度),4 ℃ 冰箱過夜;
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    6)? 用 0.1% Tween-20 PBS 洗 5 分鐘×3 次;

    7)? 滴加二抗(生物素標記的羊抗鼠/兔 IgG),室溫孵育 10 分鐘;
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    8)? 用 0.1% Tween-20 PBS 洗 5 分鐘×3 次;
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    9)? 滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶,室溫孵育 10 分鐘;
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    10)? DAB\AEC 顯色時間在顯微鏡下控制,蒸餾水洗終止顯色;

    11)? 蘇木素復染、水洗、分化后充分水洗,常規脫水透明,中性樹膠封片。
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    (二)Elivision 法:Elivision TM Super 檢測試劑盒
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    1) 60 ℃ 烤片 30 分鐘,常規脫蠟水化;?
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    2) 根據每一種抗體的要求,對組織抗原進行相應的修復【一般以 0.01M 檸檬酸緩沖液 (pH6.0) 高壓 2 分鐘修復抗原,冷卻至室溫,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗 5 分鐘×3 次】
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    3) 用 3% H202-甲醇封閉內源性過氧化物酶,室溫 10 分鐘, PBS 洗 5 分鐘×3 次;
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    4) 滴加一抗(即用型/濃縮型, 選擇合適濃度),4 ℃ 冰箱過夜;
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    5) 用 0.1% Tween-20 PBS 洗 5 分鐘×3 次;
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    6) 滴加放大劑(鼠/兔),室溫孵育 15 分鐘;
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    7) 用 0.1% Tween-20 PBS 洗 5 分鐘×3 次;?
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    8)? 滴加多聚酶結合物,室溫孵育 15 分鐘;
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    9)用 0.1% Tween-20 PBS 洗 5 分鐘×3 次;
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    10) DAB\AEC 顯色時間在顯微鏡下控制,蒸餾水洗終止顯色;
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    11) 蘇木素復染、水洗、分化后充分水洗;常規脫水透明,中性樹膠封片。
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    實驗過程中以下幾點應明確和注意:
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    1. 試劑盒選擇的建議:
    a、明確所選試劑盒的原理、特點;
    b、再根據所選組織芯片的類型選用實驗方法,如正常組織組合芯片,上皮來源腫瘤組織組合芯片,定位于胞核的一抗等優先選用 UltraSensitiveTMS-P 法,結果敏感性更高,背景染色干凈,無非特異性染色,特別適合于檢測福爾馬林固定石蠟包埋組織中低含量的抗原,陽性產物明顯突出,結果易于判斷。若反復幾次預實驗后,結果不理想,可以換用 Elivision 法,基于聚合物技術的優勢,該操作簡便,放大效果顯著,背景清晰,細胞定位更強。

    2. 保證抗原質量的建議:
    a、標準的樣本固定、處理方式;
    b、嚴格烤片溫度及時間;
    c、依據一抗要求,選擇合適的修復方式,標準的修復操作過程。

    3. 消除或減弱非特異性背景的建議:
    a、脫蠟徹底;
    b、嚴格洗滌時間和次數,滴加一抗后的洗滌每次滴加 0.1% Tween-20,洗滌除去未結合抗原或抗體,除去非特異性吸附造成的背景染色;
    c、優化選擇合適的一抗稀釋度;
    d、血清蛋白封閉應充分;
    e、確保孵育盒\濕盒平衡,保證實驗反應的水平一致性。f、顯色時間顯微鏡下控制。

    4. 保證組織芯片點樣完整建議:
    a、保證特殊處理載玻片質量;
    b、嚴格烤片溫度和時間 (60 ℃/30 分鐘);嚴格抗原熱修復的液體溫度、時間的把控,不能在修復后讓溫度驟降;
    c、應輕柔振搖洗滌,避免洗滌力度過猛。

    5. 實驗對照設定不能遺漏:
    a、對照設定用來評定實驗系統的正確性,設為陽性對照,用已知抗原陽性的切片與檢測樣本同時實驗,陽性對照應呈陽性結果;
    b、陰性對照,用不含已知抗原的樣本做對照或空白對照,實驗結果為陰性,用以排除假陽性結果。
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    西安艾麗娜生物科技有限公司技術服務中心
    二零一七年七月