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以本實驗實常用兩種實驗方法為例（下面兩種方法均為手工操作，如無特殊說明，均在室溫下進行）

1)? 60 ℃ 烤片 30 分鐘，常規脫蠟水化；

2)? 根據每一種抗體的要求，對組織抗原進行相應的修復【一般選用 Tris-EDTA (pH 8.0) 微波修復抗原，冷卻至室溫，三羥甲基氨基甲烷 (Tris) 鹽緩沖液，PBS 洗 5 分鐘×3 次】

3)? 用 3％ H₂0₂-甲醇封閉內源性過氧化物酶，室溫 10 分鐘，PBS 洗 5 分鐘×3 次；

4）滴加正常非免疫動物血清，室溫 10 分鐘；

5)? 除去血清，滴加一抗（即用型/濃縮型, 選擇合適濃度），4 ℃ 冰箱過夜；

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6)? 用 0.1% Tween-20 PBS 洗 5 分鐘×3 次；

7)? 滴加二抗（生物素標記的羊抗鼠/兔 IgG），室溫孵育 10 分鐘；

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8)? 用 0.1% Tween-20 PBS 洗 5 分鐘×3 次；

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9)? 滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，室溫孵育 10 分鐘；

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10)? DAB\AEC 顯色時間在顯微鏡下控制，蒸餾水洗終止顯色；

11)? 蘇木素復染、水洗、分化后充分水洗，常規脫水透明，中性樹膠封片。

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1) 60 ℃ 烤片 30 分鐘，常規脫蠟水化；?

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2) 根據每一種抗體的要求，對組織抗原進行相應的修復【一般以 0.01M 檸檬酸緩沖液 (pH6.0) 高壓 2 分鐘修復抗原，冷卻至室溫，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗 5 分鐘×3 次】

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3) 用 3％ H₂0₂-甲醇封閉內源性過氧化物酶，室溫 10 分鐘， PBS 洗 5 分鐘×3 次；

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4) 滴加一抗（即用型/濃縮型, 選擇合適濃度），4 ℃ 冰箱過夜；

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5) 用 0.1% Tween-20 PBS 洗 5 分鐘×3 次；

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6) 滴加放大劑（鼠/兔），室溫孵育 15 分鐘；

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7) 用 0.1% Tween-20 PBS 洗 5 分鐘×3 次；?

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8)? 滴加多聚酶結合物，室溫孵育 15 分鐘；

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9）用 0.1% Tween-20 PBS 洗 5 分鐘×3 次；

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10) DAB\AEC 顯色時間在顯微鏡下控制，蒸餾水洗終止顯色；

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11) 蘇木素復染、水洗、分化后充分水洗；常規脫水透明，中性樹膠封片。

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實驗過程中以下幾點應明確和注意：
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1. 試劑盒選擇的建議：
a、明確所選試劑盒的原理、特點；
b、再根據所選組織芯片的類型選用實驗方法，如正常組織組合芯片，上皮來源腫瘤組織組合芯片，定位于胞核的一抗等優先選用 UltraSensitive^TMS-P 法，結果敏感性更高，背景染色干凈，無非特異性染色，特別適合于檢測福爾馬林固定石蠟包埋組織中低含量的抗原，陽性產物明顯突出，結果易于判斷。若反復幾次預實驗后，結果不理想，可以換用 Elivision 法，基于聚合物技術的優勢，該操作簡便，放大效果顯著，背景清晰，細胞定位更強。

2. 保證抗原質量的建議：
a、標準的樣本固定、處理方式；
b、嚴格烤片溫度及時間；
c、依據一抗要求，選擇合適的修復方式，標準的修復操作過程。

3. 消除或減弱非特異性背景的建議：
a、脫蠟徹底；
b、嚴格洗滌時間和次數，滴加一抗后的洗滌每次滴加 0.1% Tween-20，洗滌除去未結合抗原或抗體，除去非特異性吸附造成的背景染色；
c、優化選擇合適的一抗稀釋度；
d、血清蛋白封閉應充分；
e、確保孵育盒\濕盒平衡，保證實驗反應的水平一致性。f、顯色時間顯微鏡下控制。

4. 保證組織芯片點樣完整建議：
a、保證特殊處理載玻片質量；
b、嚴格烤片溫度和時間 （60 ℃/30 分鐘）；嚴格抗原熱修復的液體溫度、時間的把控，不能在修復后讓溫度驟降；
c、應輕柔振搖洗滌，避免洗滌力度過猛。

5. 實驗對照設定不能遺漏：
a、對照設定用來評定實驗系統的正確性，設為陽性對照，用已知抗原陽性的切片與檢測樣本同時實驗，陽性對照應呈陽性結果；
b、陰性對照，用不含已知抗原的樣本做對照或空白對照，實驗結果為陰性，用以排除假陽性結果。
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二零一七年七月